產(chǎn)品及特點(diǎn)：
煙曲霉(Aspergillus fumigatus.)屬殼霉目、杯霉科、煙曲霉屬，是一種重要的致病菌，也是引起食品腐敗的一種。煙曲霉的菌落生長迅速，絨狀或作一定的絮狀，暗煙綠色，老后色變得更深。此菌嗜高溫，在 45℃或更高的溫度下生長茂盛。在糧食發(fā)熱霉變的中期和后期常大量出現(xiàn)，促進(jìn)糧溫的升高和敗壞。煙曲霉能寄生在人、鳥類及其它脊椎動物的肺部引起結(jié)核癥。也能侵染棉鈴和蘋果等，引起果實(shí)腐爛，或寄藏于種子上。因此快速檢測煙曲霉具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測煙曲霉的試劑盒。
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)煙曲霉高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
規(guī)格及成分：
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編號 |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
2×Probe qPCR MagicMix |
500μL（本色蓋） |
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試劑三 |
熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL（黃蓋） |
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試劑二 |
煙曲霉qPCR引物混合液 |
100μL（白蓋） |
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試劑四 |
煙曲霉qPCR探針 |
50μL（棕色管） |
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試劑五 |
煙曲霉探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL) |
50μL（紅蓋） |
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使用手冊 |
1份 |
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低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
6. 放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
煙曲霉探針法熒光定量PCR試劑盒
二、樣品DNA的制備：
7. 如果有 N 個樣品，設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）：
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成份 |
N+2個樣品管 |
PCR陰性對照管 |
標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7管） |
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2×Probe qPCR MagicMix |
10μL |
10μL |
各10μL |
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煙曲霉qPCR探針 |
1μL |
1μL |
各1μL |
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煙曲霉探針法qPCR引物混合液 |
2μL |
2μL |
各2μL |
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N+2個待測DNA模板 |
7μL |
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-- |
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超純水 |
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7μL |
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第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號） |
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各7μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管） |
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過程 |
溫度 |
時間 |
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預(yù)變性 |
95℃ |
3 min |
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PCR 反應(yīng)40個循環(huán) |
95℃ |
15 sec |
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60℃ |
1 min(采集FAM通道的熒光信號) |
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。